宫颈腺癌的组织学分类方法的可重复性研究
宫颈腺癌发病率逐年增加，多发于年轻女性，目前在宫颈癌患者中其发病率约为15%-20%。最近，有研究团队结合宫颈腺癌的淋巴结转移及复发情况提出了一种新的宫颈腺癌组织病理学分类。该分类方法摒弃了传统的依据病灶大小进行分期的模式，依据破坏性间质浸润的程度、淋巴脉管浸润程度将宫颈腺癌分为三类。A类宫颈腺癌：没有破坏性间质浸润、淋巴脉管浸润；B类宫颈腺癌：典型的A类腺体进一步进展，出现早期、小的破坏性的间质浸润，可能并发淋巴脉管浸润；C类宫颈腺癌：具有广泛的破坏性的间质浸润，4×区域充满融合性的浸润，或呈现倍数级生长（稳定增长），通常合并淋巴脉管浸润。在对超过名病人进行的研究表明，A类宫颈腺癌患者未出现淋巴结转移、肿瘤复发，B类患者中5%出现淋巴结转移、肿瘤复发，且淋巴结转移患者均存在淋巴脉管浸润，C类患者近25%的淋巴结转移、复发率。如果利用传统FIGO分期，A类和B类患者均为肿瘤I期，其中IA期、IB期大约各占一半。而15%C类患者可划分为II期或更高期别。研究结果表明，A类患者如果肿瘤切缘阴性，可单纯行肿瘤切除，而不必进行淋巴结取样，也不必进行术后辅助治疗。C类患者需进行进一步治疗，而B类患者可依据是否存在淋巴脉管浸润给予个体化治疗。
目前在临床工作中，依据FIGO分期、是否存在淋巴脉管浸润、肿瘤大小超过2cm、肿瘤累及宫颈间质的厚度，进行宫颈腺癌的治疗。美国国家综合癌症网络诊疗指南提出除外有保留生育功能要求，对存在淋巴脉管浸润的IA1期患者，IA2期及以上患者进行广泛手术切除及盆腔淋巴结清扫。传统FIGO分期综合了临床和肿瘤病理学检查结果，肉眼可见的癌灶为IB期，肉眼未见仅在显微镜下可见的肿瘤依据间质浸润的深度和宽度进行分期，因此精确测量肿瘤浸润深度至关重要，一般而言从上皮基底膜开始测量肿瘤浸润深度。通常病理学家更易测得鳞癌患者的癌灶浸润深度，例如起源于鳞状细胞原位癌（HSIL）的局部区域发生了浸润性病变，即使存在广泛HSIL，只有那部分病变细胞需要进行测量。而对于宫颈腺癌患者，则难以确定微小的宫颈腺癌病灶具体起源于哪个腺体，许多研究者建议从上皮基底膜表面开始测量宫颈腺癌病灶浸润深度，相当于将肿瘤浸润深度等同于测量肿瘤厚度。当浸润病灶中同时存在宫颈原位腺癌，这种测量方法可能导致宫颈腺癌FIGO分期升级。
研究表明新的分类方法较之传统FIGO分期，更好地区分出淋巴结转移、肿瘤复发低危患者。将这种新的分类方法用于临床实践具可行性。之前一项关于49名宫颈腺癌患者进行的研究也取得了相同的结果（平均配对Kappa值0.51）.
该研究针对包含原始病例在内的更大样本群体，进一步检测新的分类方法在应用中的可重复性，并通过不同病例进一步阐述其分类标准。
材料和方法
从原始名宫颈腺癌患者中筛选出84名作为研究对象，其中包括24名A类患者，22名B类患者，38名C类患者。各个分类标准中研究对象基准均匀分布，并在其中选取最具代表性的个体进行HE染色。病理诊断结合了前期研究及后续随访信息，由于缺乏相应确诊的“金标准”，对于存在争议的疑难病例，最终病理结果由第一作者及资深作者共同完成。每张HE染色图片被分发给七名妇科病理学专家，其中四名学者曾经参加前期研究。前期及本次研究之间时间跨度长达一年以上，其目的在于尽量排除前期研究团队可能存在的观察偏倚。相关诊断标准（如下）。
A类宫颈腺癌具备圆形轮廓、界限清楚的腺体，通常呈簇分布；没有破坏性的间质浸润；没有单个细胞或细胞分离；没有淋巴脉管浸润；可以存在复杂的生长形态，如呈乳头状、筛状；不存在实性生长模式，即存在结构分化；与肿瘤的深度及其与大的宫颈血管无关；B类宫颈腺癌A类宫颈腺癌进一步进展，出现局部（局限性、早期）破坏性的间质浸润；圆形腺体分离出的单个或小群肿瘤细胞，通常合并局灶性的间质结缔组织增生或炎症反应；病灶可以为单发，多发，或位于肿瘤基底部排列呈线样；淋巴脉管浸润+/-。C类宫颈腺癌以广泛的腺体浸润为特点，存在广泛破坏性的间质浸润及促结缔组织增生反应；充满了显微镜下4×放大区域下的融合性生长（5mm）：腺体，乳头状凸起（间质仅见于乳头状突起内），或粘液湖；腺体通常呈角，或具有管样生长模式，可散在有开放腺体；实性生长，组织成分分化差（结构高分类）；不考虑细胞核分化程度；淋巴脉管浸润+/-。
应用SAS9.2系统(SASInstitute,Cary,NC,USA)，统计分析包括七名研究人员在内的总体Kappa系数，每一名研究观察人员的简单和加权Kappa系数、spearman相关系数，A类患者与B类+C类患者相关kappa统计数据。我们认定：Kappa数值在0-0.2之间为微量，0.2-0.4之间为轻度，0.4-0.6之间为中度，0.6-0.8之间为大部分，0.8-1之间评定结果近乎完全一致10。通过评估数据的一致性，进而判断疾病诊断中是否存在过度或低估情况11。
在收集研究者的研究结果，对存在疑问的病例，包括对参考诊断存在较大争议的病例，出现了三种不同诊断的病例，最终病理分析由第一作者及资深作者共同进行。
结果
68例患者的研究结果与参考诊断基本吻合（81%），其中50%患者的研究结果完全或接近完全（6/7）一致。研究结果完全吻合的相关病例详见图2.
对每一位研究者的A类、B类、C类诊断进行了相关统计学分析；P1-P4代表参加了前期研究团队的四位病理学专家（表3）。简单kappa系数（非序检验）表明三名研究者的研究结果近乎完全一致，其余四名研究者的研究结果存在一定一致性。加权kappa系数统计认为六名研究者（86%）的研究结果近乎完全一致，剩余一名研究者的结果存在一定一致性。Spearman相关系数波动在0.-0.之间。总体Kappa系数为0.49，存在中度一致性。A类患者的kappa系数为0.54，B类患者的kappa系数为0.32，C类患者的kappa系数为0.59，表明C类患者的病例诊断结果最具可重复性。联合统计B类+C类患者具有相同的kappa数值，与A类患者的kappa系数相同，均为0.54。
名参考诊断为A类宫颈腺癌的患者中，名与参考诊断相吻合（77%）；名诊断为类宫颈腺癌的患者中，名与参考诊断相吻合（68%）；名参考诊断为C类宫颈腺癌的患者中，名与参考诊断相吻合（77%）。总体诊断吻合率74%。相关结果详见表4。其中6名患者前期参考诊断为A类，本次研究诊断为C类，结果均出自同一位病理学专家，贡献3%得分机会。6名患者前期参考诊断为C类，本次研究诊断为A类或B类，相关结果出自不同病理学专家，贡献6%的得分机会。此次研究统计数据表明，疾病诊断偏差率约为9%。
多数研究者对包含4名A类患者，4名B类患者，8名C类患者在内的共计16名患者前期参考诊断病理结果提出异议。仔细复查相关有争议诊断的病理切片，尽力寻找导致出现诊断偏差的可能原因。后期研究中C类患者漏诊常见于忽视了在显微镜4×区域下充满肿瘤细胞融合性浸润这一诊断标准（图3a）。本次研究中融合性浸润意指恶性肿瘤腺体之间缺乏间质填充，或在广泛融合性浸润的乳头状腺体间，仅在腺体内中心处有间质存在。融合性浸润的诊断标准并不适用于外生性乳头状腺体3，但在个别病人中，的确难以区分（图3b、3c）。当存在管样或复杂性生长，即使肿瘤面积小于显微镜下4×区域，我们也考虑诊断为C类患者（图3d）。
意外发现一些问题。一例患者，尽管病理切片缺乏典型的促结缔组织增生反应，没有腺体集聚和局部腺体变形弯曲，但存在潜在隐秘性的弥漫性浸润生长，广泛的淋巴脉管浸润，前期参考诊断为C类（图4a、4b）。一例前期参考诊断为C类，具有确凿病理诊断特征的患者，本次研究中却仅有1名研究者将其划分为C类，其余6名病理学专家均诊断为A类腺癌（图4c）。当浸润性肿瘤呈现线性生长，超出了显微镜下4×放大区域，我们将其定义为C类；忽视这些相关诊断标准，可能会造成C类患者的漏诊（图4d）。另外，肿瘤局部炎性浸润也会造成诊断困难。
B类腺癌患者早期病灶的破坏性浸润可能为局灶性、多发性，或在肿瘤边缘呈线性生长，其测量径线小于显微镜下4×放大区域，意即直径＜5mm。我们可能会漏诊这些微小个体细胞病灶，或小的腺癌细胞分离片段，研究表明，大约20%前期参考诊断为B类腺癌的病例因此被误诊为A类腺癌。
1名病理学家将一例前期参考诊断为A类腺癌的患者划分为C类腺癌；可能的原因在于A类腺癌患者的肿瘤腺体分叶相对较为柔和（图5a）。另外1例A类腺癌患者，病理切片中虽查见了分叶、外形不规则的腺体，但腺体总体仍为圆形，其病理诊断也相对较为困难（图5b）。数名前期诊断为A类腺癌患者，病理切片中查见了小的炎症病灶浸润，散在促结缔组织增生反应，但缺乏肿瘤细胞浸润，本次研究中被诊断为B类腺癌（图5c）。促结缔组织增生这一腺癌诊断标准是指梭形、松散的基质中查见散在或小的腺癌细胞浸润。A类腺癌可表现为小的、局灶性的结缔组织增生，基质松散，局部炎症反应，但缺乏腺癌细胞浸润。需要在高倍镜检下进行相关鉴别。我们对一些重复出现的诊断争议点进行了整理。一位病理学专家诊断11例原位腺癌，而前期诊断及其他观察者都倾向于将其划分为A类腺癌。数名研究者都表示了在实际观察过程中，尤其针对B类腺癌患者，存在额外附加诊断标准。当病变位于肿瘤腺腔或息肉样凸起部位，关于融合性生长这一疾病诊断标准的应用存在较大争议。至少一位病理学专家在5例观察对象中提出了绒毛样腺体这一生长模式，其中包括1名A类患者，1名B类患者及3名C类患者（均为前期诊断）。其余争论要点还集中在B类、C类腺癌患者，如何精确划分病变局灶、局限性浸润与弥漫性浸润；这些争论点提示我们制定定量标准至关重要。
讨论
关于宫颈腺癌存在两种观点，一种观点认为相较于临床中常见的宫颈鳞状细胞癌，宫颈腺癌具有侵袭性、不可预测性的生长模式12，13。另外，虽然绝大多数宫颈腺癌与高危型HPV病毒感染相关，一些罕见的与HPV病毒感染无关的组织学分型，包括透明细胞癌、微偏腺癌、胃腺癌14-18，通常难以诊断，极具侵袭性。因此在临床中我们倾向于对没有淋巴脉管浸润的FIGO分期IA1期患者施行手术切除和淋巴结清扫19。相反的，另外一种观点认为并非所有宫颈腺癌患者较之宫颈鳞状细胞癌患者，其预后相对更差，因此我们迫切需要制定一种可靠的标准，用以确定哪一部分病人可以进行相对保守治疗20-22。研究表明，病理学分类为预测宫颈腺癌结节性病变风险及疾病复发风险提供了一种安全、可靠的方法2-4。
由于多数C类宫颈腺癌患者存在不规则浸润的腺体和广泛的促结缔组织增生反应，因此最易被识别。本次研究中，病理学专家可以准确识别77%的C类宫颈腺癌患者，与我们前期研究结果基本一致。研究认为在识别腺体的分叶状结构，或融合性生长，尤其通过测量肿瘤大小作为诊断标准时相对较为困难。C类腺癌融合性生长这一诊断标准是指在显微镜下4×放大区域中存在腺体，乳头样凸起（仅在乳头样凸起内有间质存在），或包含肿瘤细胞的粘液湖，可没有明显的促结缔组织增生反应。位于肿瘤边缘或前侧呈线样生长的破坏性浸润病灶，充满了4×放大区域（45mm），可作为区分B类和C类腺癌破坏性浸润范围的另一量化性诊断标准，但有必要进一步研究以确定相关诊断数值。我们还需进一步细化相关诊断标准，制定C类腺癌患者个体化的诊断指标。
B类腺癌是指A类腺癌进一步进展，出现了早期、局灶性的破坏性间质浸润，可以为单发、多发，或在肿瘤基底部呈线样、直径＜5mm，伴或不伴有淋巴脉管浸润。此次研究发现B类腺癌患者的诊断重复率最低。大约20%B类腺癌患者被诊断为A类腺癌，虽然部分可能归因于本次研究的设计方案，我们只向研究者提供了H-E染色涂片。当不存在肿瘤的淋巴脉管浸润时，这一研究结果并不会影响患者预后；但在个别案例中出现了淋巴脉管浸润的过度诊断，提示我们仔细观察明确是否有淋巴脉管浸润至关重要。
A类腺癌表现为柱状、假复层细胞包饶的圆形腺体，没有或仅存在局灶性的间质反应，基质中没有芽殖细胞或单个细胞分布。我们需要仔细寻找以明确病变组织中尤其是肿瘤边缘是否存在淋巴脉管浸润，这会改变A类宫颈腺癌的病理分类。需要强调的是A类腺癌肿瘤可能表现为深部浸润，在肿瘤切缘阴性的活检组织、切除组织或淋巴结活检中，难以据此明确诊断为A类腺癌或B类腺癌。另外，前期诊断为A类腺癌的患者，如果肿瘤中存在纤维组织增生，炎性浸润，局部水肿或腺体结构破坏，需仔细检查以明确是否有单发的或散在小的肿瘤细胞浸润，淋巴脉管浸润，这些都将影响宫颈腺癌的病理分类。
A类腺癌需要与原位腺癌相鉴别，区分二者存在一定困难，研究认为疾病确诊率约为80%23，24。鉴别要点包括散在分布的腺体呈指状突入基质，间质反应25，淋巴脉管浸润9，肿瘤腺体生长超出正常宫颈深处，邻近厚壁血管的肿瘤腺体26，或呈复杂性生长的腺体或乳头状凸起8，24，27。需要强调的是本次研究中所有病例前期均已依照相关诊断标准规范确诊为浸润性病变。我们承认由于相关诊断标准中并未纳入破坏性间质浸润这一分类，可能导致部分原位病变被过度诊断为侵入性病变。但我们这一病理学分类系统也同时规避了一些困难，因为原位腺癌与A类腺癌的处理原则是基本相同的。
既往多数保守性治疗研究都是针对非常微小的宫颈腺癌-早期浸润癌28或微小浸润癌。微小浸润癌是指FIGO分期IA1期，或IA1、IA2期的宫颈腺癌，而不考虑是否存在淋巴脉管浸润29，美国妇科肿瘤协会29和国家综合癌症网络30均认为IA1期宫颈癌缺少淋巴脉管浸润。微小浸润性癌合并淋巴结转移的概率非常低，小于1%6-1.5%31。一项研究回顾性分析了名IA1期、IA2期宫颈腺癌患者的淋巴结转移阳性率、疾病复发率、死亡率，结果表明二者间并不存在统计学差异32。二者间相似的结局可能与病灶浸润深度的病理学测量方法有关。前文已经讨论过，相较于宫颈鳞状细胞癌，这种测量方法更易将宫颈腺癌的肿瘤厚度等同于肿瘤浸润深度；这种分类方法相对更为安全，但当广泛的宫颈腺癌原位病变中仅有少量浸润性成分，这会造成肿瘤的过度分期。通过测量肿瘤破坏性浸润的深度（DODI）并仔细观察明确是否存在淋巴脉管浸润，我们有望将本次研究中这一病理学分类方法应用于临床实践。A类宫颈腺癌DODI为0，B类宫颈腺癌DODI＜3mm，水平DODI范围＜7mm，绝大多是C类宫颈腺癌患者DODI更大。据统计，未发现A类宫颈腺癌患者合并淋巴结转移，但部分患者（包括部分最初被诊断为A类宫颈原位腺癌）可能合并卵巢转移33，34。因此我们认为可对A类宫颈腺癌患者采取与原位腺癌患者相似的临床治疗方法35。另外依据诊疗指南，临床中通常对肿瘤直径＞2cm的患者术后进一步给予辅助治疗36，但部分A类宫颈腺癌患者肿瘤大小可能超过2cm，我们建议这一宫颈腺癌的病理分类方法还可用于指导宫颈腺癌患者的术后辅助治疗。
其他脏器或其他组织学类型的肿瘤，其相关浸润模式均会影响疾病预后。相较于存在破坏性的或侵袭性间质浸润的卵巢胃肠型粘液性癌患者，存在广泛或融合性的腺体浸润的患者预后相对更好37，38。我们之前曾经探讨过扩张性VS破坏性间质浸润两分类系统是否可应用于宫颈腺癌，因为两种分类系统病人预后基本相似。但扩张性似乎不足以充分描述A类宫颈腺癌。存在破坏性间质浸润的阴道、宫颈鳞状细胞癌预后也相对更差39，40。虽然我们只针对宫颈腺癌进行相关研究，该肿瘤分类系统可能同样适用于多种肿瘤类型。另外，我们的研究还进一步证实了之前许多其他研究提出的观点—出现淋巴脉管浸润是宫颈腺癌不良预后的指标20，41。
本研究的总体重复率为74%，病理研究者观察结果与前期参考诊断的重复率为86%。两次研究结果都呈现出中度至高度可重复性4；本项研究结果的一致性、可重复性与之前针对其他规范诊疗分类系统进行的相关病理学研究结果基本吻合11，42，43。Paquette等相关学者曾提出B类腺癌、C类腺癌的病理学分类系统可提高诊断的可重复性，作者也提出两分类系统可能相对更为可取。但在本次研究中，我们统计发现两分类系统并未提高诊断的可重复性。另外我们认为位于中间范畴的B类宫颈腺癌提高了该病理分类系统的临床实用性，因为不合并淋巴脉管浸润的B类宫颈腺癌预后相对较好，而即使合并了淋巴脉管浸润，相对于C类宫颈腺癌，其生物学行为也相对更为缓和。因此我们还是推荐三分类系统。
总之，本研究与前期研究结果基本一致。针对前期诊断为A类或B类腺癌的肿瘤大体标本进行仔细检查，并明确是否有淋巴脉管浸润，对正确进行病理分类至关重要。具备A类宫颈腺癌的总体特征，但合并小的灶状纤维组织增生、基质缺失或炎症，需在高倍镜下进一步检查，可能会发现B类宫颈腺癌的病理学特征表现—孤立或小的灶状肿瘤细胞或淋巴脉管浸润。C类宫颈腺癌患者的诊断重复率最高，可能是由于弥漫性破坏性的间质浸润易于被发现，但如何确定C类宫颈腺癌肿瘤融合性，大小判别标准，实性生长模式，以及不典型C类宫颈腺癌病人的诊断还有待于进一步研究。我们目前正在考虑建立网站，利用相关示图详细解释宫颈腺癌的三分类模式。下一步研究着眼于DODI的使用，宫颈腺癌分类的应用，以及在临床工作中如何结合这一病理分类系统划分哪一部分宫颈腺癌患者可以给予相对安全的保守治疗。
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