单细胞测序与配子发生二青春期睾丸发育
美国犹他大学医学院的BradleyCairns实验室于年1月9日在CellStemCell（IF=21.5）发表文章，样本为四个遗体捐献的青春期男性睾丸样本，分别为7岁（性成熟前）、11和13岁（性成熟中）以及14岁（性成熟后），使用10xgenomics平台进行scRNA-Seq。文章还另外使用了作者之前研究发表过的两个1岁和25岁的样本。
男性的青春期涉及了睾丸生理的重大变化，包括睾丸体积增加，以及复杂的激素调节，以完成体细胞的增殖成熟和精子发生的启动，这是在儿童期静止一段时间后，通过下丘脑-垂体-性腺轴的重新激活而开始的，包括下丘脑GnRH刺激LH和FSH的释放，LH刺激Leydig细胞产生T，以及FSH刺激Sertoli细胞支持精子发生。
在青春期前，未分化的精原细胞嵌入到Sertoli细胞组成的条索中，随着青春期到来，基底层和管腔形成会产生出结构性的生精小管，涉及肌样细胞、Leydig细胞和Sertoli细胞的协调发育。但我们对整个过程的理解是有限的，包括将精原干细胞（SSC）维持在儿童期未分化状态和缓慢自我更新的机制，以及青春期开始和生精启动的过程。
研究结果
本研究一共做了四个样本的单细胞测序，每个样本两个技术重复，一共8个数据集，得到共10,个细胞，剩下7,个达到质控进入下游分析。每个细胞约包含1,-2,个基因（约Kreads）。和之前18年同课题组发表文章的1岁和25岁的样本合并后，一共为13,个单细胞。
细胞分群和注释
首先，对单细胞数据集进行tSNE分析，得到8个主要细胞群（C1-C8），如下图。
t-SNE的主要目的是高维数据的可视化，有点像我们熟知的PCA分析。每一个基因的表达量都是一个维度，上千个基因就有上千个维度，将这些维度通过t-SNE的方式降维到两个维度t-SNE1、t-SNE2，就是上面这张图了。
这些类群使用了已知的基因marker进行了注释。其中，C1-C3为生殖细胞，C1是精原细胞（UTF1+，FGFR3+），C2为精母细胞（SYCP3+），C3为减数分裂后期的精子细胞（PRM3+），C4为支持细胞（SOX9+），C5为Leydig和类肌样细胞（IGF1+和/或ACTA2+），C6为平滑肌（NOTCH3+），C7为巨噬细胞（CD14+），C8为内皮细胞（VWF+）。下图颜色越深，则代表该基因的表达量越高，可以清楚看出这些基因是某些特定类群的标志性基因marker。
生殖细胞的单独分析
重新分群
接下来，作者首先分析了C1-C3这三个类群的生殖细胞，把这些细胞从数据中抽取出来，单独进行重新聚类。
聚类结果显示，这些生精细胞可以区分为缓慢自我更新的未分化精原细胞（UTF1+，MKI67–），正在分化的精原细胞（KIT+，MKI67+），精母细胞（STRA8+，GPR85+）和精子细胞（PRM3+）。由于研究的样本是从1岁婴儿一直到25岁成年人，这几种细胞是存在发生先后顺序的，因此作者使用了拟时序分析。
生殖细胞拟时序分析
拟时序分析（PseudotimeAnalysis）根据不同细胞亚群基因表达量随时间的变化情况，构建了细胞谱系发育。这里的时间是一个虚拟的时间，因为并不是真的1岁时候采集一次样本，一直采集到25岁，而是通过谱系发育来推断细胞之间的演替过程，有点进化树的意思。scRNA-seq拟时序分析用的是monocleR包。
从拟时序分析的结果来看，生精细胞呈现一条线性的轨迹，这完全在意料之中，是一种A转化为B、B转化C、C转化为D的关系。复杂一些的细胞如果做拟时序分析时，有可能分叉，这代表了细胞在某一时刻分化为两个方向。
在上面这张图中，把1岁到25岁六个年龄阶段的样本分开来标注。
嗯，这样不是很直观，换一种表现形式：
从这个结果来看，1岁和7岁时基本上都是缓慢更新着的未分化精原细胞，到11、13岁时出现分化的精原细胞，减数分裂期的细胞也开始出现。13岁反而下降？这可能是个体之间存在青春期发育的差异。到14岁时，生殖细胞的组成已经和25岁的成人差不多了。
生殖细胞的免疫荧光
接下来作者使用了免疫荧光来确认scRNA-seq的结论。DAPI染的是细胞核，UTF1基因是未分化精原干细胞（spermatogonialstemcell，SSC）标志物（绿色，和DAPI位置相同），而开始分化的精原细胞则会存在KIT这样的细胞增殖标志物（红色，KIT在细胞膜定位，所以是一个红圈儿）。
UTF1+/KIT-代表没有开始分化的精原细胞，而UTF1-/KIT+代表已经开始分化的精原细胞，UTF1+/KIT+则为不完全分化的精原细胞。随着年龄的增长，精原细胞开始分化，但仍然维持着自我的有丝分裂。因此，婴儿期和青春期之间存在三个独立阶段：（1）未分化的精原细胞处于静止或缓慢自我更新的阶段；（2）精原细胞增殖（有丝分裂）短暂时期，精原细胞分化有限且不完全，发生在青春期初期，逐步过渡为（3）建立稳定平衡的精原细胞自我更新和分化，开始参与配子的发生。
到这里，对于生殖细胞类群的单独分析就完成了，包括重新对这些细胞进行分群，重新找各自的marker基因，单独进行拟时序分析来观察细胞分化路线，并使用免疫荧光来对睾丸组织进行蛋白表达验证。因此，整篇文章的结构为：整体把所有细胞做一遍，分群完毕后，每个类群单独拿出来做一遍。接下来是其它细胞类群，就不写得那么详细了。
Sertoli细胞的单独分析
同样，作者使用UTF1和SOX9两个marker对组织进行了染色，可以很清晰的看到，在7岁未进入青春期时，性腺中还是由精原细胞和支持细胞组成的索状结构，到进入青春期后逐渐形成管腔结构的生精小管。
和之前的分析一样，对总体分析中的第四个Sertoli细胞类群进行重新分群（图示略），并进行拟时序分析，发现成熟的Sertoli细胞在青春期前存在两个状态，作者将它们命名为未成熟细胞#1和#2。
从基因表达模式上来看，似乎#1和成熟Sertoli细胞特征更为类似（见下图），包括较高雄激素受体AR和相关基因表达、较高线粒体转录水平、较低核糖体蛋白基因表达等。
对比未成熟和成熟的Sertoli细胞，差异表达基因大概共有1,个。在Sertoli细胞成熟过程中，除了与细胞骨架、细胞形态发生和细胞外基质等基因上调以外（这些都在意料之中），还有免疫相关基因（如ISG15）也被上调，这说明了Sertoli细胞在保护睾丸防止感染。
Leydig细胞和肌样细胞
有趣的是，总体聚类分析将Leydig细胞和肌样细胞聚在了一起，为类群C5。照例，把这部分细胞拆出来重新分群，发现Leydig细胞和肌样细胞有共同的祖先，并且进入青春期后开始分道扬镳。
怎么看出来这两条分化路线的？靠的还是基因marker。MAFB和NR4A1标记了胎儿时期Leydig细胞和肌样细胞的前体，而进入青春期后，用DLK1和IGF1来标记Leydig细胞，而使用ACTA2和MYH11标记肌样细胞。如下图。
从拟时序分析上，也可以明显看出两者共同祖先（Progenitor）在青春期这个时间节点，分化出了Leydig细胞和肌样细胞。
细胞类群清楚了以后，就到了在它们之间寻找表达差异的时候了。差异基因还是1,个左右，随着细胞向肌样细胞发展，细胞骨架和细胞粘附相关基因开始表达（MYH11绿色信号逐渐增强，下图左），而Leydig细胞谱系则开始表达分泌相关的基因，并符合具有类固醇生成功能的细胞表达模式（CYP11A1绿色信号逐渐增强，下图右）。
两个变性人的睾丸单细胞分析
这篇文章还做了两个变性人睾丸样本的分析，分别是50岁和26岁，决定变女人后，使用了睾酮拮抗剂抑制，并使用了雌二醇19个和16个月，然后切除了睾丸。研究接着对它们进行了单细胞测序分析。结果发现，成人抑制睾酮后，分化的生殖细胞数目大幅度减少，未分化的精原干细胞（State01）却存活了下来。
对于Sertoli细胞来说，T被抑制后，Sertoli和11岁或13岁的样本情况更为类似（下图中的Tf1、Tf2表示T被抑制后的变性人睾丸样本，细胞类型类似于11岁和13岁时）。
小结
这篇文章在实验设计上的优势，在于使用了单细胞转录组测序技术，以及采用了青春期前后的睾丸样本。单细胞测序可以区分不同的睾丸细胞类群，而不同年龄样本又可以观察青春期前后的差异。两者相结合，就可以观察各个种类的细胞在青春期前后的动态变化了。文章的很多结论从分子层面印证了之前对于睾丸发育生物学的理解，并且这些数据还可以支持很多更进一步的分子机制研究。这些研究可能最终体现在不育症的治疗上，由于清楚了青春期发育期间各种睾丸细胞的基因表达规律，可以在此基础上开发分子诊断标记，甚至在明确分子病因后，开发针对性的靶向治疗方法。
